《植物基因工程实验技术指南（第二版）》是新编写的系统阐述植物基因工程实验技术的学术专著，与《植物基因工程实验技术指南（第二版）》编委会于2014年出版的《植物基因工程》理论书配套使用。全书共新增18章，新编写内容占全书的2/3以上。每个实验除详细叙述实验操作程序外，还设有实验解析：分析实验结果，指出关键技术，解释实验原理，从而培养实验者举一反三的创新能力，做到学以致用。同时《植物基因工程实验技术指南（第二版）》还汇集了靠前外近期研发的许多新成果、新技术，引入了新的图表及近三年的文献，在附录中收集了植物基因工程实验相关的新数据资料、目的基因结构功能及实验试剂等，以便使用。《植物基因工程实验技术指南（第二版）》是植物基因工程研究人员推荐的实验手册，可作为植物基因工程研究的工具书，也可作为高等院校高年级生物技术专业本科生及硕士和博士研究生的实验参考教材。教师可根据教学大纲需要从中选择适当的实验内容灵活使用；也可作为学生参加课外科学研究活动、拓宽知识、激发兴趣、启蒙创新实践的实验指导书。

前言
篇 核酸分离提取技术
章 微生物DNA提取技术 2
实验1-1 大肠杆菌质粒DNA提取 2
1-1-1 质粒DNA小量常规提取法 2
1-1-2 质粒DNA小量试剂盒提取法 3
1-1-3 质粒DNA大量提取法 5
实验1-2 农杆菌Ti质粒DNA提取 7
实验1-3 农杆菌双元载体中mini-Ti质粒提取 7
实验1-4 M13噬菌体DNA提取 9
1-4-1 M13噬菌体单链DNA提取 9
1-4-2 M13噬菌体RF DNA提取 9
第2章 植物DNA提取 10
实验2-1 植物细胞总DNA提取 10
2-1-1 可用于PCR的DNA微量制备 10
2-1-2 SDS法 10
2-1-3 CTAB法 11
2-1-4 高盐法提取多糖类植物总DNA 11
2-1-5 食用油中提取DNA的方法 12
实验2-2 植物核DNA提取 13
2-2-1 核DNA的大量提取法 13
2-2-2 核DNA微量提取法 14
2-2-3 核DNA柱式抽提试剂盒法 15
2-2-4 核DNA磁珠法抽提试剂盒法 15
实验2-3 植物叶绿体DNA提取 17
2-3-1 密度梯度离心DNase处理法 17
2-3-2 高盐低pH方法提取叶绿体DNA 18
2-3-3 多糖类植物叶绿体DNA分离提取 19
实验2-4 植物线粒体DNA提取纯化 20
第3章 植物RNA提取技术 22
实验3-1 植物总RNA提取 22
3-1-1 异硫氰酸胍法 22
3-1-2 苯酚法 22
3-1-3 LiCl沉淀法 23
3-1-4 一步提取法 23
3-1-5 植物总RNA提取纯化试剂盒法 23
3-1-6 Fruit-mateTM for RNA purification法 24
3-1-7 RNAiso for polysaccharide-rich plant tissue法 25
3-1-8 TRIzol法 26
实验 3-2 总RNA中mRNA的分离提取 27
3-2-1 层析法 27
3-2-2 poly（A）mRNA 提取纯化试剂盒法 27
3-2-3 MagnosphereTM UltraPure mRNA purification Kit法 28
实验3-3 植物microRNA的提取分离 29
3-3-1 microRNA提取试剂盒法 29
3-3-2 miRcute miRNA 提取分离试剂盒法 30
第4章 核酸提取物纯度、浓度及定量检测 32
实验4-1 细菌DNA提取物纯度及浓度检测 32
4-1-1 分光光度（紫外吸收）法 32
4-1-2 琼脂糖凝胶电泳法 32
实验4-2 植物DNA提取物纯度及浓度检测 33
4-2-1 分光光度（紫外吸收）法 33
4-2-2 琼脂糖凝胶电泳法 33
4-2-3 荧光光谱法 33
实验4-3 植物RNA提取物纯度及浓度检测 34
4-3-1 分光光度（紫外吸收）法 34
4-3-2 琼脂糖凝胶电泳法 34
篇主要参考文献 36
第二篇 基因分离克隆技术
第5章 目的基因的PCR扩增技术 38
实验5-1 cDNA合成 38
5-1-1 AMV法 38
5-1-2 M-MLV法 38
5-1-3 链cDNA合成试剂盒法 39
实验5-2 基因保守序列的PCR扩增 40
5-2-1 一般的PCR方法 40
5-2-2 PCR酶试剂盒法 40
5-2-3 PCR反应要素 41
5-2-4 PCR反应条件：温度、时间和循环次数 42
5-2-5 常用PCR反应试剂盒 43
实验5-3 反转录PCR（RT-PCR）扩增技术 44
5-3-1 植物总RNA提取 44
5-3-2 反转录PCR（RT-PCR）扩增 44
5-3-3 一步法反转录PCR（RT-PCR）试剂盒法 45
实验5-4 PCR扩增产物的克隆 46
5-4-1 平末端连接 46
5-4-2 TA克隆 52
实验5-5 反向PCR（Reverse-PCR） 55
实验5-6 实时荧光定量PCR 55
5-6-1 样品RNA的抽提 55
5-6-2 RNA质量检测 56
5-6-3 样品cDNA合成 56
5-6-4 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR 56
5-6-5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板 57
5-6-6 待测样品的待测基因实时定量PCR 57
5-6-7 实时定量PCR引物 57
5-6-8 电泳 57
5-6-9 实时荧光定量PCR试剂盒法 57
实验5-7 cDNA末端快速扩增技术（RACE） 59
5-7-1 总RNA的提取 59
5-7-2 反转录PCR 59
5-7-3 RACE方法扩增3′端 59
5-7-4 RACE方法扩增5′端 60
第6章 基因芯片技术分离目的基因 63
实验6-1 制备芯片 63
6-1-1 基片的制备 63
6-1-2 点样探针的制备 64
6-1-3 基因芯片点样 64
实验6-2 样品制备 65
6-2-1 植物RNA提取 65
6-2-2 检测提取的RNA 65
6-2-3 纯化总RNA（Qiagen的RNeasy Mini Kit或Micro Kit） 65
6-2-4 纯化总RNA的定量检测 65
6-2-5 cDNA合成 65
6-2-6 纯化cDNA（Affymetrix GeneChip Sample Cleanup Module） 66
6-2-7 cRNA合成和纯化（GeneChip IVT Labeling Kit） 66
6-2-8 纯化cRNA的定量检测 67
6-2-9 片段化cRNA 67
实验6-3 芯片杂交 67
实验6-4 芯片图像处理 68
实验6-5 芯片数据预处理 69
实验6-6 芯片差异表达基因分析 69
实验6-7 全基因克隆 69
第7章 插入突变分离克隆目的基因 71
实验7-1 T-DNA标签法 71
7-1-1 T-DNA载体的构建 71
7-1-2 对转化后代进行表型分析 71
7-1-3 对突变体进行遗传分析 71
7-1-4 PCR法分离T-DNA插入位点的侧翼序列 71
7-1-5 证实T-DNA的插入导致表型的变异 71
实验7-2 转座子标签法 71
7-2-1 农杆菌介导法把转座子导入目标生物体 72
7-2-2 转座子的初步定位 72
7-2-3 转座子插入突变的鉴定及分离 72
7-2-4 转座子在目标生物体内的活动性能检测 72
7-2-5 分离克隆目的基因 72
实验7-3 sAc/Ds双系统法 72
7-3-1 sAc的转化植株和Ds的转化植株的获得 72
7-3-2 转化株杂交，挑选杂合sAc和Ds的子一代植株 73
7-3-3 Ds在sAc产生的转位酶帮助下转座，产生表型突变株 73
7-3-4 建立对应于变异株的基因文库或cDNA文库 73
7-3-5 筛选对应的基因克隆并了解该基因的特征 73
7-3-6 回复突变株的获得 73
第8章 图位克隆目的基因 74
实验8-1 构建遗传作图群体 74
实验8-2 筛选连锁分子标记 74
实验8-3 突变基因的染色体初步定位 75
实验8-4 基因精细定位 75
实验8-5 构建基因组文库 76
实验8-6 利用分子标记筛选基因组文库 76
实验8-7 PCR扩增测序寻找突变位点 76
实验8-8 基因组高通量测序寻找突变位点 76
实验8-9 验证克隆基因的正确性 77
第9章 基因文库技术分离目的基因 78
实验9-1 cDNA文库构建 78
实验9-2 BAC文库构建 80
实验9-3 YAC文库构建 85
实验9-4 TAC文库构建 89
0章 差异表达基因的分离技术 92
实验10-1 差别杂交与扣除杂交 92
10-1-1 原代目的基因培养 92
10-1-2 总RNA提取 92
10-1-3 层析法分离提纯目的基因 92
10-1-4 制取cDNA探针 92
10-1-5 cDNA扣除文库的构建 92
10-1-6 cDNA扣除文库的扩增及初步鉴定 94
实验10-2 mRNA差异显示技术（DDRT-PCR） 94
10-2-1 总RNA提取 94
10-2-2 RNA样品中微量DNA的去除 94
10-2-3 建立反转录归类反应体系 95
10-2-4 PCR选择扩增 95
10-2-5 差别条带的回收 95
10-2-6 回收条带的PCR扩增 95
10-2-7 扩增产物的纯化 96
实验10-3 代表性差异（RAD）和抑制性扣除杂交（SSH） 96
10-3-1 总RNA提取 96
10-3-2 磁性球珠分离mRNA 96
10-3-3 抑制消减杂交文库的构建 96
10-3-4 载体的连接及转化 98
10-3-5 插入片段长度的蓝白斑筛选与鉴定 98
10-3-6 菌体的培养与保存 99
10-3-7 序列分析和序列提交 99
实验10-4 交互扣除RNA 差别显示技术（RSDD） 99
10-4-1 扣除杂交 99
10-4-2 差异显示 99
10-4-3 表达分析 100
实验10-5 随机引物PCR的RNA指纹法 100
10-5-1 RNA的提取和制备 100
10-5-2 总RNA的DNase处理 100
10-5-3 反转录及PCR扩增 100
10-5-4 差异片段回收及克隆测序 101
1章 功能蛋白组技术分离目的基因 102
实验11-1 用于双向电泳分析的植物总蛋白提取及浓度测定 102
11-1-1 酚法提取植物总蛋白 102
11-1-2 三氯乙酸沉淀法提取植物总蛋白 103
11-1-3 植物总蛋白提取试剂盒法 103
11-1-4 Bradford法测定蛋白质浓度 105
11-1-5 蛋白质浓度测定试剂盒法 105
实验11-2 双向电泳分离目的蛋白 109
11-2-1 IPG胶条的水合和等电聚焦 109
11-2-2 IPG胶条的平衡 111
11-2-3 SDS-PAGE电泳 111
实验11-3 双向电泳凝胶染色 111
11-3-1 考马斯亮蓝染色法 111
11-3-2 SYPRO Ruby染色法 112
11-3-3 硝酸银（AgNO3）染色法 112
11-3-4 考马斯亮蓝蛋白质染色试剂盒法 113
实验11-4 用于质谱分析的多肽样品制备 113
2章 酵母双杂交系统分离克隆目的基因 116
实验12-1 双杂交文库构建及筛选 116
实验12-2 酵母双杂交文库筛选目的基因 117
……
第三篇 NDA重组及载体构建技术
第四篇 目的基因遗传转化技术
第五篇 转基因植物的检测鉴定
第六篇 转基因植物的生物学特性及表现遗传学检测
第七篇 生物信息学技术在植物基因工程中的应用
第八篇 转基因植物的安全性评价检测
附录