本书按照DNA重组技术的操作程序来安排实验，即从核酸的提取→目的基因的制备→体外DNA的重组(酶切与连接)→重组DNA分子引入受体细胞→转化子的筛选→重组DNA分子的鉴定等步骤编排成一个综合性大实验。在这个综合性实验中，每一步实验既相对独立又与下一步实验紧密相连，只有获得前一个步骤的正确实验结果才能开始下一个实验。

本书为国家示范性高职院校一线教师和企业专家共同开发的教改成果教材。本书按照DNA重组技术的操作程序来安排实验，即从核酸的提取→目的基因的制备→体外DNA的重组(酶切与连接)→重组DNA分子引入受体细胞→转化子的筛选→重组DNA分子的鉴定等步骤编排成一个综合性大实验。在这个综合性实验中，每一步实验既相对独立又与下一步实验紧密相连。通过这些实验，学生可以熟练掌握分子生物学最基本的技术，并对DNA重组技术有一个比较全面而系统的概念。书中同时穿插了分子生物学其他必备的实验，以便培养学生比较全面的分子生物学实验技能。本书分为6个项目，每个项目由若干个任务组成，并且有“必备知识”作为任务的理论补充，“拓展知识”可以扩展学生的知识面，“项目思考”中设计的问题有助于培养学生独立思考能力和创新意识。

本书可作为高职高专生物技术相关专业的教材，也可供相关技术人员参考。

项目一 质粒pMD18-T-EGFP的分离、纯化和鉴定1

 一、项目介绍1

 二、学习目标1

 三、项目实施1

任务一 创建和谐包容性的工作环境1

任务二 清洗、包扎常用玻璃器皿和耗材2

任务三 配制并灭菌各种浓度单位的溶液4

任务四 创建遗传信息流示意图6

任务五 碱裂解法分离提取质粒pMD18-T-EGFP及浓度测定6

任务六 琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒pMD18-T-EGFP12

任务七 细菌基因组DNA提取及质量检测15

 四、项目思考16

 五、必备知识17

（一）基因工程的发展简史17

（二）基因工程实验规范23

（三）溶液浓度的计算与换算24

（四）生物学遗传信息流25

（五）DNA的结构27

（六）核酸的理化性质32

（七）乳糖操纵元33

（八）载体（一）39

 六、拓展知识40

（一）基因组大小与基因数量40

（二）基因操作对人类生存环境的影响44

（三）真核生物DNA的提取45

（四）真核基因组DNA的制备技术47

项目二 绿色荧光蛋白基因(egfp)转录产物RNA的提取52

 一、项目介绍52

 二、学习目标52

 三、项目实施52

任务一 总RNA的提取及含量测定52

任务二 mRNA的提取与纯化56

任务三 RNA琼脂糖凝胶电泳57

任务四 Northern blot58

 四、项目思考60

 五、必备知识60

(一)RNA操作注意事项60

(二)RNA的空间结构和功能61

(三)mRNA的合成与加工63

 六、拓展知识70

(一)植物病毒的RNA提取70

(二)动植物组织mRNA提取71

(三)兔肝RNA的制备71

(四)人体细胞总RNA和mRNA的提取73

项目三 体外扩增目的基因——绿色荧光蛋白基因（egfp）74

 一、项目介绍74

 二、学习目标74

 三、项目实施74

任务一 以DNA为模板扩增绿色荧光蛋白基因（egfp）——PCR74

任务二 以mRNA为模板反转录扩增绿色荧光蛋白基因——RT-PCR76

任务三 实时荧光系统通过反转录定量（RT-qPCR）对基因表达进行分析79

任务四 cDNA文库构建技术（一）——磁珠法提纯mRNA82

任务五 cDNA文库构建技术（二）——cDNA链的反转合成84

 四、项目思考86

 五、必备知识86

（一）DNA的生物合成86

（二）RNA的生物合成90

（三）DNA聚合酶的类别和性质92

（四）其他工具酶94

（五）PCR技术及其在基因克隆中的应用97

（六）PCR产物的克隆103

 六、拓展知识105

（一）巢式PCR105

（二）cDNA文库构建技术106

项目四 将绿色荧光蛋白基因（egfp）克隆到载体上111

 一、项目介绍111

 二、学习目标111

 三、项目实施111

任务一 利用内切酶对载体和基因（egfp）进行酶切111

任务二 酶切片段的脱磷技术113

任务三 DNA片段的回收技术114

任务四 基因的重组连接技术116

任务五 cDNA文库构建技术（三）——cDNA的连接、包装及转染119

任务六 RACE技术扩增构建全长cDNA文库120

 四、项目思考124

 五、必备知识124

（一）限制性内切酶分类和催化机制124

（二）DNA甲基化酶131

（三）DNA连接酶133

（四）其他工具酶的催化机制136

（五）载体（二）137

 六、拓展知识143

（一）分子标记143

（二）RFLP技术148

（三）RAPD技术148

（四）AFLP技术149

（五）SSR技术149

项目五 将含有egfp基因的质粒转化到E.coli中151

 一、项目介绍151

 二、学习目标151

 三、项目实施151

任务一 准备溶液及器皿151

任务二 感受态细胞的制备及热激法将质粒转化到E.coli中152

任务三 感受态细胞的制备及电击法将质粒转化到E.coli中154

任务四 农杆菌转化植物细胞155

任务五 磷酸钙转染动物细胞157

 四、项目思考158

 五、必备知识158

（一）感受态细胞158

（二）外源基因导入真核细胞的方法159

（三）目的基因的筛选策略161

 六、拓展知识163

（一）基因打靶技术163

（二）从基因到基因组164

项目六 基因（egfp）及基因产物(EGFP)检测166

 一、项目介绍166

 二、学习目标166

 三、项目实施166

任务一 酶切重组载体鉴定目的基因166

任务二 Southern blot167

任务三 分子杂交167

任务四 DNA测序鉴定目的基因一致性170

任务五 ELISA检测表达产物172

任务六 SDS-PAGE检测蛋白表达173

任务七 Western杂交176

任务八 等电聚焦电泳177

任务九 蛋白产物的定量测定179

 四、项目思考182

 五、必备知识182

（一）基因表达系统182

（二）Southern blot192

（三）分子杂交技术192

（四）DNA测序194

（五）报告基因的应用195

（六）重组体的筛选与检测197

 六、拓展知识204

（一）基因芯片204

（二）基因治疗的基本原理和应用前景208

参考文献211