发酵技术是食品、制药、酶制剂等行业生产的主要技术手段。诸葛斌等编著的《现代发酵微生物实验技术》旨在阐述发酵技术的核心，为相关研究技术人员快速掌握发酵技术提供指导，是发酵工程及相关专业的学生和技术人员培养的必修课。

本书延续了第一版编写中“图文并茂，有论述，有操作，有结果”的特色。在内容上保持了显微技术、微生物细胞特殊结构的观察、噬菌体、标记菌种的获得与应用、原生质体系列育种技术和固定化细胞生物转化等实用技术，并结合本研究室近几年的研究经验，对基因工程育种技术部分实验进行了修改，增加了基因敲除、定点突变、表达蛋白提纯等实验技术，使本书体系更完善。此外，还增加了第八章“菌种保藏方法与机构”和第二章中“酵母子囊孢子的形成及观察”等相关实验技术。

《现代发酵微生物实验技术》的作者诸葛斌等所在的发酵工程学科是我国最早授予的国家重点学科之一，参与编写者在教学与科研上都有较为丰富的实践经验和研究成果。

本书延续了《现代发酵微生物实验技术》(第一版)编写中“图文并茂，有论述，有操作，有结果”的特色。

在内容上保留了显微技术、微生物细胞特殊结构的观察、噬菌体、标记菌种获得与应用、原生质体系列育种技术和固定化细胞生物转化等实用技术，并结合本研究室近几年的研究经验，对基因工程育种技术部分实验进行了修订，增加了基因敲除、定点突变、表达蛋白提纯等实验技术，使该章节体系更完善。

新增了第八章“菌种保藏与机构”和第二章中“酵母菌子囊孢子的形成及观察”等相关实验技术。

本书适合高等院校微生物学、发酵工程、生物工程、食品工程等专业的高年级本科生及研究生阅读使用，也可供相关科研人员参考。

第一章 显微技术

 第一节 显微观察

一、相差显微镜

 实验1-1 相差显微镜的使用

二、荧光显微镜

 实验1-2 荧光显微镜的使用

三、电子显微镜

 实验1-3 细菌、酵母菌超薄切片的透射电镜观察

 实验1-4 噬菌体的透射电镜观察

 实验1-5 质粒DNA的透射电镜观察

 实验1-6 酵母细胞的扫描电镜观察

 第二节 显微摄影

 实验1-7 显微摄影、菌落摄影和凝胶摄影

 第三节 放射自显影

 实验1-8 硝酸纤维素滤纸上标记DNA的放射自显影

 第四节 显微操作技术用于单细胞分离

 实验1-9 显微操纵器用于单细胞分离

 实验1-10 显微操纵器用于酵母子囊的解剖及子囊孢子单孢化

 实验1-11 玻璃微型工具的制作

 第五节 流式细胞仪测定细胞核内DNA的含量

 实验1-12 流式细胞仪计数法

第二章 微生物细胞特殊结构的观察

 第一节 染色技术

一、染色的基本原理

二、染料

三、染色

 实验2-1 真菌的荧光染色与观察

 第二节 细胞主要结构成分的分离与观察

 实验2-2 革兰阳性细菌细胞壁的制备

 实验2-3 酵母细胞壁甘露聚糖的制备

 实验2-4 细胞壁的形态观察

 实验2-5 革兰阴性菌细胞外膜蛋白的分离

 实验2-6 细菌荚膜的观察

 实验2-7 细菌鞭毛的观察

 实验2-8 微生物细胞核的观察

 实验2-9 细菌染色体DNA的分离与观察

 实验2-10 异染颗粒的观察

 实验2-11 酵母细胞内脂肪颗粒和肝糖颗粒的观察

 实验2-12 酵母液泡及线粒体的提取

 第三节 芽孢、子囊孢子和假菌丝的观察

一、芽孢

 实验2-13 细菌芽孢形成及发芽的观察

 实验2-14 伴孢晶体的观察

二、酵母子囊孢子

 实验2-15 酵母子囊孢子的形成及观察

 实验2-16 酿酒酵母单倍体细胞的制备与鉴定

三、流式细胞术

 实验2-17 酿酒酵母染色体倍性鉴定

四、酵母假菌丝

 实验2-18 酵母假菌丝的观察

第三章 噬菌体

 实验3-1 噬菌体的分离与纯化

 实验3-2 高效价噬菌体原液的制备

 实验3-3 溶源菌的鉴定

 实验3-4 抗噬菌体产α-淀粉酶菌株的选育

第四章 标记菌种的获得与应用

 第一节 富集培养技术在获得标记菌种中的应用

一、营养缺陷型富集法在原核细胞中的应用

 实验4-1 芽孢杆菌营养缺陷型的筛选

二、营养缺陷型富集法在真核细胞中的应用

 实验4-2 酵母营养缺陷型的筛选

 实验4-3 青霉菌营养缺陷型菌株的筛选

三、浓度梯度法富集抗性突变株

四、富集法在研究次级代谢的重组DNA技术中的应用

 第二节 营养缺陷型标记菌种的获得

一、诱变方法

二、淘汰野生型

三、检出缺陷型

四、营养缺陷型生长谱的确定

 实验4-4 芽孢杆菌营养缺陷型生长谱的确定

 第三节 呼吸缺陷型标记菌种的获得

 实验4-5 酵母呼吸缺陷型的筛选

 第四节 抗反馈调节 抗性突变株的获得与应用

 实验4-6 氨基酸抗反馈调节 突变株的选育

第五章 原生质体系列育种技术

 第一节 工业菌种育种的策略

 第二节 原生质体融合育种

一、原生质体融合育种的特点

二、原生质体融合育种步骤与要点

三、原生质体再生率和融合率的计算

 实验5-1 芽孢杆菌的原生质体融合

 实验5-2 链霉菌原生质体融合

 实验5-3 小单胞菌的原生质体融合

 实验5-4 酿酒酵母的原生质体融合

 实验5-5 丝状真菌的原生质体融合

 第三节 原生质体转化育种

 实验5-6 芽孢杆菌原生质体转化

 实验5-7 质粒DNA转化链霉菌原生质体

 实验5-8 酿酒酵母的原生质体转化法

 实验5-9 真菌原生质体转化

 第四节 原生质体诱变育种

 实验5-10 芽孢杆菌种间融合子F-2 6-2 原生质体诱变育种

 实验5-11 紫外线诱变原生质体选育L-谷氨酸高产菌

 第五节 原生质体技术中的一些特殊技术

一、紫外线照射原生质体增加融合率

二、供体原生质体的热灭活

三、原生质体电融合技术

 实验5-12 电诱导酵母原生质体融合

四、遗传转移

 实验5-13 原生质体融合法转移酵母线粒体及杀伤质粒

第六章 基因工程育种技术

 第一节 基因工程的基本过程和原理

一、载体

二、DNA重组用酶

 第二节 大肠杆菌基因工程

一、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

 实验6-1 用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌

 实验6-2 用氯化钙制备感受态大肠杆菌

 实验6-3 用PEG制备和转化大肠杆菌感受态细胞

 实验6-4 大肠杆菌的电击转化

二、大肠杆菌中质粒的提取与纯化

 实验6-5 质粒的大量提取与纯化

 实验6-6 质粒的小量提取

 实验6-7 用硅胶膜分离法小量提取质粒

三、外源基因在大肠杆菌中的高表达

 实验6-8 载体和基因的酶切

 实验6-9 基因与载体的连接

 第三节 非大肠杆菌微生物基因工程

一、芽孢杆菌基因工程

 实验6-10 枯草杆菌感受态细胞的制备和转化

 实验6-11 枯草杆菌染色体DNA的提取

 实验6-12 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）碱性果胶酶基因的PCR扩增

 实验6-13 从电泳凝胶中分离枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）碱性果胶酶基因

 实验6-14 枯草杆菌转化子质粒的提取和检测

 实验6-15 地衣芽孢杆菌感受态细胞的诱导形成及其高效电转化

二、酵母基因工程

 实验6-16 酵母染色体DNA的提取

 实验6-17 酿酒酵母的乙酸锂完整细胞转化法

 实验6-18 单链载体DNA的制备

 实验6-19 酵母菌质粒DNA的提取

 实验6-20 碱性果胶酶基因重组巴斯德毕赤酵母的构建

 实验6-21 羟酸还原异构酶基因多拷贝重组啤酒酵母的构建

 第四节 其他基因工程育种常用技术

 实验6-22 酿酒酵母W303甘油酯酶GPP2基因敲除技术

 实验6-23 粗糙脉孢菌漆酶基因的定点突变技术

 第五节 蛋白质纯化技术

 实验6-24 利用His标签进行Ni柱纯化甘油脱氢酶的分离技术

 实验6-25 离子交换色谱技术分离纯化蛋白质

第七章 微生物细胞固定化方法

 第一节 载体结合法

一、表面吸附法

二、共价结合法

 实验7-1 Amycolatopsis sp.ST2710的载体固定化

 第二节 交联法

 第三节 包埋法

一、藻酸钙凝胶包埋法

 实验7-2 酿酒酵母的藻酸钙固定化

 实验7-3 固定化枯草杆菌连续生产耐热α-淀粉酶

二、κ-角叉胶包埋法

 实验7-4 κ-角叉胶一步包埋法

 实验7-5 κ-角叉胶二步包埋法

 实验7-6 固定化酵母连续生产酒精

 实验7-7 固定化细胞的回收与活细胞计数

三、聚丙烯酰胺凝胶包埋法

 实验7-8 大肠杆菌的聚丙烯酰胺凝胶固定化

四、光交联树脂前聚体包埋法

 实验7-9 光交联树脂固定化原生质体

第八章 菌种保藏方法与机构

 第一节 菌种的退化与防治措施

一、菌种退化的现象及原因

二、防止退化措施

 第二节 常用菌种保藏

一、菌种保藏的原理

二、常用的菌种保藏方法

 实验8-1 斜面保藏法

 实验8-2 液体石蜡保藏法

 实验8-3 载体保藏法

 实验8-4 甘油管低温保藏法

 实验8-5 液氮冷冻保藏法

 实验8-6 真空冷冻干燥保藏法

 第三节 基因工程菌的保藏

 第四节 著名菌种保藏及专利菌种保藏机构

一、中国微生物菌种保藏管理委员会组织系统

二、国际著名菌种保藏机构

三、国际确认的专利菌种保藏机构（IDA）

参考文献